| 仪器名称：扫描型激光共聚焦显微镜 |
品牌型号：LSM900 | |
摆放位置：第二理工楼725 | |
负责老师：陈红霞+第二理工楼725 | |
关键性能参数： 镜头：10x、20x、40x、63x/Oil 激光器：405nm、488nm、561nm、639nm 超高分辨检测器：Airyscan 活细胞：带活细胞培养小室 功能：荧光拍照、共定位、Z轴（3D图像）拍照，时间轴拍照，活细胞拍照，拼图，光漂白等 | |
注：共聚焦开机前点倒掉房间两台抽湿机的水箱，确保抽湿机正常运行。
开机
1、打开电源：
1）打开墙上的空气开关；
2）打开稳压电源开关，确认稳压电源显示220V；
3）打开稳压电源上面和防震台侧边的排查开关；
2、按照如下顺序开启各部件电源：
1）打开“System”（开关1）和“Components”（开关2）；
2）将Laser Module“LM”的钥匙从“0”转到“1”（开关3）；
3）打开电动载物台电源“SMC 2009”（开关4）和电动显微镜电源“Power Supply 232”（开关6）；
注：相机开关“Focus Controller3”（开关5）若电源打开显示屏亮则不用管；
4）打开金属卤化物灯X-Cite（开关6）；
5）扫码上机，打开电脑。
6）启动ZEN软件（蓝色），选择“ZEN system”。
仪器开机完成，可进行实验拍照。
关机
1、将显微镜镜头调至空位，各个电源按照与开机相反的顺序进行关闭。
2、关完仪器，待数据拷贝完成后，关闭软件和电脑，扫码下机。
3、关闭排插、稳压器、总开关。
4、盖上防尘罩，倒掉抽湿机箱内水，带走所有个人物品，锁门离开。
（注：若在佰能或者贵重仪器共享平台看到1个小时内有其他老师或同学预约仪器，可不用关机，只扫码下机。）
仪器使用注意事项
1、周一至周五8:00-12:00,14:30-18:00请联系陈红霞老师（第二理工楼735）
非上班时间12:00-14:30、18:00-22:00联系助管
周六、周天8:30-12:00,14:00-17:30 联系助管
使用的同学注意每年助管学生联系方式，地点706
2、参加过培训的用户开通权限后可自由在佰能或者贵重仪器共享平台预约使用仪器；未参加过培训的同学确实急需使用仪器需提前联系管理老师学习，学会后再行开通权限预约使用，第一次使用仪器需提前跟管理老师联系，管理老师看过操作没问题方可自己使用。
3、仪器开机前先倒掉房间内两台抽湿机的水，打开空调，确定房间温度在24℃ 以下、湿度在50% 以下再开机。
4、仪器用完清理桌面、盖好防尘罩。
5、离开时不可带走房间内酒精喷壶等物品，一定带走个人制造的垃圾。
6、用完仪器如实登记使用情况。
7、仪器登记本、仪器操作手册、擦镜纸不可乱放、写字。
8、使用活细胞成像后请一定按实际关机、关闭二氧化碳气阀、取走个人物品。
9、使用完仪器离开房间前请倒掉房间内两台抽湿机的水。
10、仪器用完离开房间一定记得锁门。
11、申请和使用仪器请加QQ群113858982。
具体仪器功能操作指引
（一）多通道荧光拍照
1、在“Locate”界面下选择快捷键，在镜下观察需要拍摄的样品区域，把需拍摄的区域放在视野中央；
2、进入“Acquisition”界面；
3、选择之前保存好的光路设置→“channel”和“Acquisition mode”设置；
4、或者新建光路设置→“Smart Setup”；
5、“smart setup”中选择染料名称，并选择拍摄方式后，“OK”。
Smart setup模块右侧有conforcal模块和Airyscan模块可选，conforcal模块即为普通的共聚焦模式。Airyscan模块为超高分辨模式，仅在最高倍数下使用，建议拍摄线粒体、内质网、高尔基体等细胞器时使用。
三种拍摄方式
A、Fastest：拍摄速度最快，发射波长接近的荧光染料间存在串色现象；
B、Best signal：拍摄速度最慢；基本避免了发射荧光的串色；
C、Smartest（Line）：结合上述两者优势，减少串色的同时拍摄速度较快，但是光路中硬件设置不能改变。
普通样本推荐使用Best signal、变化较快的样本推荐使用Smartest或者Faster。
6、在“live”下设置Channels中的激光强度“Laser”，针孔大“Pinhole”，检测器“Gain”值，以及“digital gain”或“digital offset”；每个track单独设置， 选中该track（选中track高亮）；
A、“Pinhole”一般设置为1 AU，增大Pinhole可以提高图像亮度，但会增加非焦面信息；减少Pinhole可以增加景深，但是会减少图像亮度；
B、“Gain”和“Digital Gain”增加可以增加图像亮度，但是也会提高背景噪音。“High Intensity Laser Ranger”：不勾选最小激光值能达到0.01%，但最高值分别只能达到3.5%（405），4.5%（488） 和5%（561、640）勾选后激光值能达到100%，但最小值不能低于0.2%。
设置原则保证图像不要过曝，尽量减少背景噪音：在live下选择“range indicator”可以显示出曝光程度；
7、在Acquisition Mode下主要设置如下参数:
A、通过scan area选择扫描区域或通过图像窗口下的“crop”选择扫描区域；
B、设置Scan Speed：扫描速度越慢，信噪比越好，但光漂白越多；
C、Averaging：增加averaging次数可以减少噪音，但会增加扫描时间；
D、Direction：双向扫描可以减少扫描时间；
E、Frame Size：一般选择512×512 或 1024×1024，图像越大，扫描时间越长、内存越大。
8、若需要添加明场，选中添加明场的track，在imaging setup勾选T-PMT；
9、选择需要成像的track，单击“Snap”；获得一张多通道图像。
以上为普通拍摄图片流程。
可以通过Experiment Manager来保存拍摄的参数，或打开已经保存的数据（czi格式），通过“Reuse”来调用上次拍摄的参数设置。
（二） Z-Stack（3D图像）拍摄
Z-Stack既3D成像，两种模式，主要使用“First/Last”模式，通过上下边界决定3D成像 的Z轴范围；另一种是“Center”模式，主要通过设定Z轴的中间位置和3D厚度来决定成像范围。
1、选择Z-stack；
2、在“First/Last”模式下，选择z轴扫描范围：在预览状态下，设置起始“Set First”和结束“Set Last”位置，单击“Optimal”设置最佳间隔；单击“Start Experiment”开始拍摄。
3、center模式下，live下选择成像的中间位置， 单击“center”，然后设置需要层扫的层数Slices，并单击“optimal”；单击“Start Experiment”开始拍摄。
4、多通道荧光拍摄Z-stack需要考虑光切厚度不一致的问题：
4.1、可以通过点击“Match Pinhole”自动调节不同track的针孔使光切厚度相似；
注：这种方法的缺点在于可能会使长波长的针孔过于小，不利于弱荧光成像。
4.2、通过手动调节针孔到一致，可以保证荧光强度的同时，保证光切厚度一致。多个track全部选择，手动调整pin值到同样大小。
（三） 长时拍摄（时间轴）
1、选择“Time Series”；
2、拍摄要持续的时间，如循环数cycles或者其他具体时间；
3、循环之间的间隔Interval；
interval：两次循环开始时间的间隔，因此interval包含了上一个循环的拍摄时间；
3、防焦点漂移：
由于长时间拍摄时间序列可能出现z轴漂移的问题，所以需要结合自动对焦来拍摄，软件自动对焦有Intensity和Reflex两个模式，其中Intensity—适合于荧光样品而且亮度较高，Reflex—适合于指定焦面，非荧光最强焦面。
3.1、选择“Software Autofocus”；选择适合的自动对焦频率；选择“Intensity”对焦模式； 单击“Start Experiment”开始time series试验。
3.2、选择“Reflex”对焦模式；单击“Find Offset”等待自动测量介质表面到样品的距离；等待测量结束后，“Distance to cover glass”后的数据会更新；单击“Start Experiment”开始time series试验。
注：使用“Intensity”自动对焦会寻找检测范围内荧光最强的信号作为焦平面，除软件自动对焦外，还可使用Definite Focus来稳定焦距。
3.3、预览下找到需要稳定的焦面位置；在“Focus Strategy”里选择“Definite Focus”；点击“Start Experiment”后选择“Continus Experiment”。
4、对多个位置进行时间采集时，可以获得更多的数据。需要结合“Time Series”和“Tiles”中的“Positon”功能：
选择“Time Series”和“Tiles”；在“Tiles”中点击“Positions”，通过预览移动载物台到感兴趣的点，点击“+”，把该位置保存在“Position”列表中；时间序列如前所述设置；
5、若拍摄时间过长，可选择打开二氧化碳气瓶和活细胞培养系统，在软件右侧调整CO2浓度和活细胞培养箱的温度；将载物台上的架子换成活细胞培养盒，将细胞放入活细胞盒内进行后续实验。
注：活细胞培养盒由于密封不够严，CO2浓度会有一定偏差，若细胞对CO2浓度敏感建议把浓度调高一点。
（四）拼图
在“Tiles”模块下“Tiles”方法代表以现在视野为中心拍摄拼图，
1、选择“Tiles”下的“Tiles”方法；
2、“X” & “Y”分别代表水平和垂直方向拼图范围；
3、点击“+”，将要拼图的范围添加到拼图区域中；
4、“Start Experiment”
5、 “Stake”方法能够通过定义拼图边缘自动计算拼图大小，完成拼图：
5.1、“Stake”下通过移动载物台到想拼接的样品边缘，单击“+”，添加边缘范围。所有边缘定义后，点击“Done”，软件自动定义拼图范围。
5.2、“Start Experiment”。
6、“Option”中几个关键参数：
6.1、“Tile Overlap”代表图片边缘互相重叠百分比，一般默认10%；
6.2、“Travel in Tile Regions”代表拼图时的方向： “Comb”：单方向拼图；“Meander”：双向拼图；“Spiral”：螺旋形从中向外拼图。
6.3、“Stitching During Acquisition”在拼图后自动拼接，消除拼图中的接缝。
7、高级拼图功能主要包括两个部分：
可以通过拼图前分析拼图区域的焦距变化，有利于校正拼图不同焦距的问题（support point）；
如果同时配置有CCD，可以通过CCD的快速成像来获取预扫图像，辅助拼图区域的选择（preview scan）；
7.1、建立好拼图范围后选择“Advanced Setup”，在右侧看见扫描区域，并进入下方选项“Support Points”
7.2、在“Support Points”选项下选择支持点，这些支持点将帮助你确定拼图区域内的焦距变化；
设定好需要分布的支持点的行列数量后点击“Distribute”，拼图区域上出现黄色小圆点，代表支持点，可以手动调节这些点的具体位置。
7.3、在“Tiles”窗口下选择“Focus Surface（verify） ”， 点 击 “Verify Tile Regions/Positions”对选好的support points进行校正；
7.4、根据配置不同，主要包括以下三种校正方法：
a. None（Manual adjustment）手动校正，在预览模式 “Live”下， 双击第一个 SP（ Support Point）进行手动调焦后保存焦距位置”Set Z & Move to Next “，随后对后续SP 进行逐个校正；
b. Autofucus（AF）软件自动对焦，通过软件计算的方法找到最佳焦距；
c. Definite Focus（DF）自动对焦系统，需要硬件Definite Focus支持，通过DF能够迅速找到介质表面来确定样品焦面。
7.5、选择AF校正方法后选择“Use AF to Verify the Remaining”，软件会自动对所有Support Points进行焦距校正；
7.6、选择DF校正方法后，
① 选择第一个”Support Point”点，点击“Move to Current Point”;
② 选择“Run DF and Set Z”，等待Definite Focus矫正结果；
③ 最后选择“Use DF to Verify the Remaining”，软件会自动对所有Support Points进行焦距校正。
当校正SP结束后，选择“Close”关闭Verify窗口
7.7、校正所有SP后，选择适合的“Interpolation Degree”；样品表面越不平整需要Interpolation Degree越高，选择的SP数量超Interpolation
Degree需要的最小值可以增加计算的可靠程度。
7.8、随后在“Focus Strategy”工具栏中确定如上图所示选项：对焦方法为“Use Focus Surface/Z Values Defined by Tiles Setup”，Focus Surface的方法为“Local （per Region/Position）;
7.9、上述设置结束后，点击“Start Experiment”拼图。