光谱型共聚焦扫描显微镜

发布者：系统管理员2发布时间：2024-08-20浏览次数：23

	仪器名称：光谱型共聚焦扫描显微镜
	品牌型号：LSM700
	摆放位置：第二理工楼725
	负责老师：陈红霞第二理工楼735
关键性能参数：镜头：10x、 20x、 40x、63x/Oil 激光器：405nm、 488nm、561nm、639nm 用途：荧光拍照、光漂白、荧光共定位等。

开机

1）打开激光器后端的按钮，打开激光器前端钥匙，箱体上指示灯亮起为激光器打开；

2）打开显微镜开关，注意在LED触摸屏初始化阶段不可转动硬件；

3）打开汞灯开关，汞灯打开后需要预热5min后使用，且汞灯开启30min内不可关闭、汞灯关机30min内不可开启；

4）多次点击显微镜LED屏上的“+”号，激活LED屏；

5）打开电脑，进入操作系统后，双击软件图标“ZEN 2008”，可进行后续实验拍摄。

关机

1）关闭汞灯；

2）关闭激光器，包括箱体前面的钥匙和后面的控制按钮；

3）显微镜镜头调至空位，关闭显微镜系统控制开关，关闭扫描载物台电源；

4）关闭软件：File→Exit 退出共聚焦软件；

5）关闭电脑操作系统、显示器、扫码下机；

6）灯箱充分冷却后，再放防尘罩；

7）如果长时间不用，关闭总电源。

具体实验操作指引

1、进入软件

1）打开电脑进入操作系统后，进入软件。

2）进入Srart system,用于激光扫描取图分析。

3）软件界面功能：扫描取图(Acquisition)、图像处理（Processing）、维护（Maintain）

2、放置样品

选择将要用到的物镜倍数，将样品放置在载物台上，将显微镜镜体归位。

3、各模块功能的操作

3.1显微拍照

1） online→ocular→GFP/DAPI/RHOD，先用低倍DAPI找到目的细胞，再选择其他光源和倍数进行观察→offline

2） Acquisition →smart setup→选择荧光通道→选择荧光扫描模式（Bestsignal、Fastest、best compromise）→Apply

3）逐个通道优化调节

New →Channels →选择并激活将要调节的通道（在相应的Track1前面的小方框内打勾并激活）→pin值建议选1Au→Auto Exposure 自动曝光→点击live 调节焦平面→点击life→调节Master Gain/Digital Offset/Digital Gain/Pinhole的激光强度，优化图像的目标信号和背景

4）调好图像质量后，将所有用到的通道均选中。

5）拍摄参数设置：Frame Size 的值越大，扫描的图像越清晰，但是扫描每张图片所用的时间越长，一般扫描时Speed<8。

6）New-Snap

3.2 三维成像

1）先如2.1优化好图像的拍摄质量的各个参数。

2）将焦平面调至部件图像信息时，点击Set Last，反向将焦平面调至不见图像信息时点击Set First，点击Interval系统将自动计算出拍摄厚度。

3）点击optimize sectioning and step

4）点击Match pinhole

5）在Acquisition Mode窗口中设置拍摄参数

6）New→Snap

3.3 光漂白

1）在Time、Bleatch及Region的模块功能前打勾。

2）利用Region 选中漂白的区域。

3）Time模块：Time series→Interval数值改为0.0。

4）Bleatch模块：Bleatching→Start Bleaching after #Scans前面的框内打勾，后面选择从第几幅图后开始漂白（如从第3副图后开始漂白）→Iterations后面选择用激光连续激发的次数（如50次）→再选择漂白的激光光源（如EGFP可以用488激光漂白，注意405可以漂白所有荧光）